Elektronový mikroskop

I když lze mikroskop sestrojit s libovolným zvětšením, dokázal Ernst Abbe, že jím nemůžeme pozorovat libovolně malé objekty. Publikoval vztah pro tzv. difrakční mez

kde α je úhel mezi optickou osou objektivu a nejvíce odchýleným paprskem, který z pozorovaného objektu ležícího v optické ose ještě objektivem projde, a n je index lomu prostředí, v němž se objekt nachází. Minimální hodnota d, která nastává pro α = π/2 je d = λ/(2n). Proto objekty mnohem menší než vlnová délka, například viry nebo atomy, nejsou optickým mikroskopem viditelné. Kdybychom tedy chtěli dosáhnout atomárního rozlišení, museli bychom použít záření s vlnovou délkou řádově tisíckrát menší než vlnová délka viditelného světla – tedy rtg záření. Jeho použití je však znemožněno řadou praktických obtíží.

Hans Bush poukázal na velkou podobnost mezi chováním světelného paprsku při průchodu čočkou a chováním elektronových paprsků v magnetických polích válců. Na jeho práci navázal jeho žák F. Wolf, který vytvořil první elektronogram. Výsledků se ujaly firmy AEG a Siemens-Halske, které začaly s vývojem elektronových mikroskopů pro vlastní potřebu. Na jejich práci navázali v americké firmě Bell Telephone Clinton Davisson a Lester Germer, když v roce 1927 provedli experiment podobný experimentu s rentgenovými paprsky, který provedl Max von Laue. Na rozdíl od něho použili urychlené elektrony a získali stejné výsledky jako on, tzn. že elektrony způsobily tytéž interference jako rentgenové záření. Elektrony se tedy chovají jako vlny a mají vlnovou délku srovnatelnou s rentgenovým vlněním. To byla poslední rána klasické fyzice.

Vlevo obrazec vzniklý pomocí rentgenového záření; vpravo obrazec vzniklý pomocí urychlených elektronů.
Zdroj: KARLSON, P. Odhalujeme taje přírody. Praha: Česká grafická unie.

Zjistili, že elektron s vyšší energií má nižší vlnovou délku než elektron nízkoenergetický. Elektron s dostatečně vysokou energií má vlnovou délku srovnatelnou s velikostí atomu. Ve stejném roce objevil Hans Busch, že rotační magnetické pole působí na svazek elektronů jako magnetická čočka. Přitom ohnisková vzdálenost této čočky se mění podle intezity magnetického pole. První elektronový mikroskop využívající soustavy elektromagnetických čoček v sérii byl postaven Max Knollem a Ernstem Ruskou v roce 1933 a v krátkém čase bylo dosaženo lepší rozlišovací schopnosti než je teoretická mez rozlišení světelného mikroskopu. Rozlišovací mez elektronových mikroskopů závisí na použitém urychlujícím napětí. U komerčně vyráběných přístrojů se pohybuje od 100 do 400 kV.

Elektronový mikroskop Ernsta Ruska.
Zdroj: commons.wikimedia.org. Under Creative Commons.

Elektronové mikroskopy s urychlovacím napětím 80 kV byly sériově vyráběny firmou Siemens od roku 1939. Jejich rozlišovací schopnost byla kolem 1 nm (několik meziatomových vzdáleností). Vzhledem k relativně nízkému urychlovacímu napětí se zpočátku pracovalo s tenkými blanami organických laků, pomocí nichž se vytvořil negativní otisk všech detailů povrchu materiálu. Později se podařilo elektrolyticky ztenčit kovové fólie tak, že byly pomocí 80 kV elektronů prosvětlitelné. A tak bylo umožněno přímo pozorovat poruchy uvnitř krystalové mříže, jako jsou dislokace, vrstevné chyby, hranice zrn nebo disperzně vyloučené částice. Elektronovou difrakcí bylo možné zjistit krystalografickou orientaci velmi malých oblastí krystalu nebo částic o velikosti kolem 1 μm a konfrontovat tyto údaje s přímým obrazem vnitřní struktury kovů a slitin. Postupný vývoj stále lepších materiálů a dokonalejší přístrojové techniky znamenal zlepšující se rozlišovací schopnost mikroskopů, která dosáhla 0,4 nm v roce 1970.

Princip rastrovacího mikroskopu.
Zdroj: Techmania Science Center. Autor: Magda Králová. Under Creative Commons.

Zdrojem elektronových paprsků je elektronová tryska, která se skládá z wolframového vlákna, fokusační elektrody a anody. Elektrony emitované vláknem jsou urychlovány polem anody, na níž je napětí 40 – 200 kV podle typu mikroskopu, a fokusovány v úzký svazek s malým otvorovým úhlem. Tento paprsek se dále fokusuje kondensorem na pozorovaný objekt, umístěný ve speciálním držáku blízko ohniska objektivu. Rychlost elektronů je až 0,7c a při konstrukci čoček se tak musí počítat i s relativistickými efekty. Elektronové paprsky přicházejí po průchodu předmětem, ve kterém nastává rozptyl elektronů, do objektivu, který vytvoří první zvětšený obraz předmětu blíže ohniskové roviny projekční čočky. Kontrast obrazu je podmíněn různým rozptylem elektronů v různých bodech předmětu. Zvětšení u elektronového mikroskopu závisí na ohniskové délce objektivu a na jeho vzdálenosti od roviny obrazu. První obraz se obyčejně pozoruje na pomocném stínítku, umístěném blíže ohniskové roviny projekční čočky. Ve středu stínítka je otvor, který vymezuje část prvního obrazu, jež se promítá projekční čočkou na hlavní stínítko. První obraz se zvětší projekční čočkou ještě několikrát. Celkové zvětšení je pak rovno součinu zvětšení objektivu a projekční čočky.

V současné době se používá dvou základních typů elektronových mikroskopů, tyto mikroskopy se navzájem liší svojí konstrukcí: prozařovací (transmisní, označovaný anglickou zkratkou TEM) a rastrovací (skenovací, označovaný jako SEM). Transmisní elektronový mikroskop se používá k prohlížení velmi tenkých řezů tkání, do tloušťky 100 nm, při vysokém zvětšení a s velkou rozlišovací schopností. Tyto mikroskopy dosahují rozlišovací schopnosti až 0,1 nm, které lze využít jen pro fyzikální účely a v technických aplikacích. Při mikroskopování biologických objektů je reálně dosažitelná rozlišovací schopnost vždy nižší - přibližně 2 nm. Pro studium biologických objektů, se obvykle používá zvětšení v rozmezí 5 000 až 30 000 krát. Rastrovací elektronový mikroskop, který poprvé sestrojil Vladimír Zworykin, slouží k prohlížení povrchových detailů buněk a dalších struktur. Příprava vzorku spočívá v tom, že se pokryje tenkou vrstvou těžkého kovu a poté se po něm přejíždí (řádkuje) svazkem elektronů. Rastrovací elektronové mikroskopy dosahují rozlišovací schopnost přibližně 10-20 nm, zvětšují v rozmezí 20 až 50 000 krát a zvětšení je plynule nastavitelné.